如何確定發(fā)光測量的微孔板間的交叉污染？

北京亙辰科技有限公司  Frank Han

    過去十幾年，發(fā)光實(shí)驗(yàn)因具有*的特異性及靈敏度，且簡單易用，多應(yīng)用于藥物開發(fā)研究?，F(xiàn)代光學(xué)測量儀器，即便發(fā)光底物的光子發(fā)射水平極低依然能夠準(zhǔn)確進(jìn)行計(jì)數(shù)。引起研究者們對SBS / ANSI標(biāo)準(zhǔn)微孔板設(shè)計(jì)中固有的光學(xué)干擾以及信噪比的極大關(guān)注。這篇短文比較了三個(gè)不同品牌制造商的微孔板中觀察到的光學(xué)干擾，發(fā)現(xiàn)使用黑色基底孔板可顯著提高檢測的靈敏度。

分光光度法

    該研究比較了兩個(gè)不同品牌制造商的固體白色聚苯乙烯矮板與獲得的Porvair Sciences設(shè)計(jì)的白色單孔與實(shí)心黑色基底板的組合（圖1）。用螢火蟲熒光素酶的發(fā)光測定做對比。有三種基于微孔板檢測獲得光學(xué)數(shù)據(jù)的方法。zui簡單的方法是吸光度測量。根據(jù)Beer-Lambert定律，測量透射或吸收的單色光，可簡單測出每孔中的相對濃度。酶標(biāo)儀使用原理。

圖 1. Porvair *的白孔黑底96孔熒光檢測板

    熒光檢測靈敏度更高。在熒光計(jì)中，簡單的截止濾波器可以從檢測光中去除反射的激發(fā)波長，僅留下發(fā)射波長。靈敏度卻是吸光度測量法的10倍以上。通過使用單色儀降低激發(fā)和發(fā)射波長的帶寬來實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度。這種熒光計(jì)可以增加一個(gè)數(shù)量級的靈敏度。

生物發(fā)光是某些動物和植物物種展示的自然發(fā)光現(xiàn)象，有水母發(fā)光蛋白和螢光素兩種常見發(fā)光機(jī)制。通過用熒光素酶基因構(gòu)建轉(zhuǎn)染細(xì)胞，熒光素酶可以用作報(bào)告基因以評估細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性或?yàn)楦咄亢Y選提供測定細(xì)胞凋亡的ATP濃度，檢測非常靈敏。這種發(fā)光測定法由幾家生命科學(xué)公司以AequoScreen ^TM，LucLite ^TM，ATPLite ^TM，OneGlo ^TM命名。發(fā)光計(jì)或多標(biāo)記讀取儀是能夠讀取吸光度，熒光或發(fā)光模式的多用途光譜儀。圖2為三種光學(xué)檢測方法。

圖2:光度法檢測

微板設(shè)計(jì)考慮

    用于檢測開發(fā)和高通量篩選的微孔板通常由聚苯乙烯聚合物制造。

    當(dāng)在篩選中使用熒光素酶在孔板上觀察高動態(tài)范圍出現(xiàn)困難時(shí)，相鄰的孔若顯示過強(qiáng)或過弱的信號，會導(dǎo)致孔之間的光學(xué)干擾，而得出錯(cuò)誤的結(jié)果。一定量的可見光通過板的白色塑料孔壁“泄漏”，低信號也會在相鄰孔板中被錯(cuò)誤附加而被檢測到。當(dāng)讀取與低濃度信號相鄰的更亮的孔時(shí)，誤差zui大。使用分離的“煙囪”設(shè)計(jì)可以減少這種誤差，但卻不能消除誤差。圖3顯示Porvair白色固體96孔“煙囪”板（左圖）。每個(gè)孔具有與板矩陣分離的單獨(dú)形成的孔壁。

為了克服白色塑料孔壁的光“泄漏”問題，Porvair Sciences開發(fā)*的96孔黑底白孔板并獲得了。（圖3右圖）。的“雙射”工藝技術(shù)使得黑色聚苯乙烯板基底與白色孔板結(jié)合。這種“雙射”模具也用于制造具有透明底板的白色或黑色孔壁的熒光檢測板，Porvair Sciences Krystal 2000^TM零干擾板便是底部讀取吸光度和熒光檢測的耗材。其配方中含有高達(dá)18％TiO₂的亮白色孔板結(jié)合1％炭黑基底上，該板的光學(xué)干擾全部被消除。

數(shù)據(jù)表明：Porvair的黑底白孔板與其他兩個(gè)制造商的固體白板相比較，黑白板的孔間干擾分別降低82％和56％。

研究方法

在BMG Labtech的POLARStar Omega光譜儀使用5ul含有熒光素和螢火蟲熒光素酶的溶液移液到每個(gè)96孔板的C4孔中（在下面的數(shù)據(jù)中顯示為“P”）并在510nm處讀數(shù)。加入5uL等分的過氧化氫反應(yīng)。從每個(gè)樣品孔周圍的空的孔中讀取四個(gè)數(shù)值，每個(gè)讀數(shù)持續(xù)1秒，取平均值。熒光素酶信號在8-10分鐘內(nèi)快速衰減，信號下降到幾乎為初始水平的50％時(shí)讀數(shù)。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備一個(gè)板，注意從未開封的包裝中選擇干凈板。其他品牌的孔板重復(fù)該流程。使用相同類型的空白板做背景讀數(shù)以進(jìn)行信噪比計(jì)算。

圖3. 樣品位置和樣品周圍的各個(gè)測量位置

結(jié)果

Porvair 96孔黑白板的計(jì)算信噪比為192000：1，而實(shí)心白板的信噪比為178000：1，背景顯示有用的可測量信號增加7.5％。

結(jié)論

   結(jié)果清楚地表明，Porvair科學(xué)的復(fù)合黑底白孔板提供了用于篩選和藥物開發(fā)中低水平熒光素酶的測定。通過炭黑的有效淬滅和二氧化鈦增加反射率的組合產(chǎn)生*的信噪比和*的動態(tài)范圍，使篩選者有機(jī)會在較低的檢測水平或減少試劑濃度的情況下篩選微弱的信號。

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關(guān)于Porvaier-Sciences

    Porvair-Sciences，微孔板產(chǎn)品的制造專家，服務(wù)生命科學(xué)，生物技術(shù)，醫(yī)藥研發(fā)和分子生物學(xué)的微孔板解決方案的所有應(yīng)用，也為各*生物公司設(shè)計(jì)zui通用的過濾板，包括Waters，Millipore，Qiagen，Whatman，GE Healthcare，Varian，Biotage、當(dāng)然還有Porvair。